免疫印跡中免疫沉淀蛋白的制備
 
    1．對(duì)照   
    實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)置應(yīng)包括能與免疫抗體共沉淀的樣品和能與非免疫抗體共沉淀的樣品。通過(guò)兩者比較可以鑒別免疫抗體所識(shí)別的條帶和非特異性的背景條帶(如來(lái)自重鏈的條帶)。此外還應(yīng)該包括含有已知的或標(biāo)準(zhǔn)量的待測(cè)抗原的陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性對(duì)照可以是含有已知或標(biāo)準(zhǔn)量待測(cè)抗原的任何樣品，來(lái)源于細(xì)菌或桿狀病毒超常表達(dá)系統(tǒng)或來(lái)源于已充分鑒定的細(xì)胞系。該樣品不必經(jīng)過(guò)免疫沉淀但應(yīng)在鄰近的膠道和其他樣品同時(shí)上樣電泳。它可提示免疫印跡是否成功，并對(duì)抗原的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行比較。如果陽(yáng)性對(duì)照中抗原的量是已知的，可粗略估計(jì)待測(cè)樣品中抗原的含量。
 
    2．準(zhǔn)備工作
準(zhǔn)備1個(gè)70℃水浴箱。
 
    3．需要的溶液
    不含DTT的Laemmli樣品緩沖液(20％SDS、10％甘油、60mmol／LTris，pH 6．8和0．01％溴酚藍(lán))；
    lmol／LDTT(—20C貯存)
 
    4．操作步驟
    (1)將樣品緩沖液加入吸附抗原和抗體，并經(jīng)過(guò)洗滌的A蛋白或G蛋白微珠中。使樣品緩沖液和微珠的體積比率至少為2：1。5：1左右更好，但一般不超過(guò)10：1。
    Tris/GlycineSDS—PAGE樣品應(yīng)用緩沖液的條件是：2％SDS、100mmol／LDTT(取自—20T3存放的lmol／L貯存液，臨用前加入)、60mmol／LTris(pH 6．8)、0．01％溴酚藍(lán)和10％甘油。
    (2)樣品置70C水浴加熱至少5rain。除特殊情況外，在凝膠內(nèi)加樣之前不必去除微珠。
    至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。
樣品既可立即使用也可凍存。—20C存放的樣品可穩(wěn)定保存數(shù)月。
 
    5．常見(jiàn)問(wèn)題
    將免疫沉淀制備的蛋白用于免疫印跡時(shí)，來(lái)自免疫沉淀的抗體會(huì)出現(xiàn)在印跡膜上，該抗體可被二抗試劑檢出。通?？贵w重鏈和輕鏈的大小并不干擾待測(cè)抗原的鑒定。然而，若待測(cè)抗原的大小在50kDa或25kDa左右(大約為重鏈和輕鏈多肽的大小)，有兩種解決辦法。一是可將免疫沉淀抗體共價(jià)結(jié)合在A蛋白或G蛋白微珠上；其二是采用直接檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。