ELISA雙抗體夾心法步驟詳解：

1、抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號，干擾后續(xù)實驗的進行。

2、免疫識別 在96孔板上包被抗體后，加入待測樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時間，通常是1-2小時。此時酶標(biāo)板上的抗體與待測抗原進行特異性識別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機鹽等成分的影響。

3、洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對應(yīng)的識別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。

4、酶標(biāo)信號輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強度呈正相關(guān)。